カロリメーターマスターへの道 Vol.9
自力でトラブルシューティング(DSC編) その1

> ここに登場する人物とストーリーはフィクションです。
テクニカルに関する内容に関しましては、大阪府立大学客員研究員 深田先生にご助言をいただいております。

ページ下の「ダウンロード」ボタンより、本文中に登場する、
「DSCトラブルシューティングまとめ」と「VP-DSC 複数ピークがある データ解析手順」がダウンロードできます。


【前回までのお話】

丸番製薬の仲村さんは、深田先生の下でVP-DSCでRNase Aの測定、解析について習得できました。

【今回のお話】
仲村さんは自社サンプルの測定を行うことになりました。
未知のサンプルの測定は始めてだけど、注意事項を遵守すれば大丈夫よね。
タンパク質の測定でパラメータ設定の目安がない場合は、こちらに示した条件での測定を試みてみてください。得られたデータに応じて、スキャン速度を上げたり、Filter periodを調整したりしてみてください。
仲村さんは、25 - 85℃、スキャン速度を60℃/hにして測定を行い以下のデータを得られました。
コントロール測定の再現性もOK。ベースラインの傾きも近似しているし、サンプルデータはコントロールデータよりもCp値が下になっているのでこちらもOK。Scan5をコントロールデータとして使用して解析をする、と。
うーん、もう少し高温まで測定したほうがベースラインは引きやすかったかもしれないわ。次回は100℃まで上げて測定をしてみよう。
続いてベースラインの差し引き。ΔCpは不要なので、Subtract BaselineはYesを選択。
目的はピークトップだから、ToolsからのPick Peaksで十分ね。
補足します。前回までの解析では、フィッティングによるものとIntegrate from 0を使った方法をご案内していました。ただし、Integrate from 0では複数のピークトップを求めることができません。ただ単にピークトップだけを求めたいときには「Pick Peaks」という機能を使うと便利です。
なお、フィッティングを選ぶか、ピークトップを選ぶかは、測定する方の目的に因るため、どちらが正しい、ということではありません。
【補足】Pick Peaksウィンドウの見方
Search RectangleとMinimum Heightの数値をうまくコントロールして、ピックトップを見つけられるようにします。
ついでだから、フィッティングでもパラメータを求めてみようかしら。2つピークがあるデータをフィッティングするのは初めてね!モデルはNon-2 State: Cursor Initを選んで、Number of peaksは2と入力。
ピークトップをダブルクリックして初期値を与えてOK。
あら?初期値の緑色の線がずれてしまったわ!ソフトウェアのバグかしら??
とりあえず200 Iterをクリックしてフィッティングをかけてみよう。
Errorが出たわ、、、何でかしら、、、
仲村さん。どうされましたか?

先生、フィッティングがうまくいかないんです。
そのようですね。以前私も同じエラーが出たことがあったのですが、その時はサンプル濃度の単位が間違っていましたよ。サンプルの濃度はどれくらいでしたか?
1.44 μMです。
私と同じトラブルですね。もう一度データを開きなおして、Normalize Conentrationボタンを押してみてください。
はい。あ!単位がmMになってます。
そうですね。濃度を直して解析しなおしてみてもらえますか?
あっ!今度は初期値がセットしたところになっているわ。
でも、フィッティングをするとまたErrorが出てきたわ。Tm2をfixして解析、と書いてあるわ。
補足します。このようなエラーが出た場合、OKをクリックします。続いて、メニューバーのDSCからモデルを選び、これまでと同様にフィッティングの作業を実施します。
先生、フィッティングできました!
そのようですね。でも仲村さん。フィッティングの状態はどうですか?1つ目のピークがちょっとずれていませんか?
そうですね。
ドメインはいくつあると考えられていますか?
上司に確認してみます。
仲村さんは上司の田中さんに電話をしました。
田中さん。先日お預かりしたDSC用のタンパク質ですが、ドメインは2つでよろしいですか?
え?ドメインごとにTmが違うのまでDSCでわかるのですか?
はい。今解析したのですが、明らかに2つのピークが得られました。そこで解析を行ってみたのですが、2つのピークで解析をするとフィッティングがあまり良好でなかったんです。
なるほど!実はドメインは3つあるんですよ。それも見極められますかね?
ドメイン3つですね。試してみます。
結果、期待していますよ!
仲村さんは、ピーク数を3つにして解析を試みることにしました。
先生。ドメイン3つらしいです。でも、どの辺に3つめのピークがあるのか、見極めが難しいです。
2つのピークでフィッティングしたデータを見ると、1つめのピークの前半にピークの肩が見えませんか?右のグラフの赤い矢印で示したあたりをピークトップとみなして解析してみてはいかがでしょうか?
なるほど。こんな感じでしょうか?           
あと、変数は少なくした方が計算しやすくなりますから、Tm2とTm3のVary?を固定したほうがよいですね。
わっ!フィッティングがよくなりました!Chi-sqr is not reducedが見えたので、Tm2とTm3も変数にして、、、
すごいっ!
仲村さん。なかなかよいデータではないですか!それに、ITCのときよりは、すんなりと測定ができるようになりましたね。
そうですね。気泡の混入がなければ、測定そのものはシンプルだったので、ITCのときよりは楽でした。でも、ITCのときに、溶液の充填の方法や、なぜ気泡が入るとDP値が下がるか、などを理解できていたことが役立ったと思います。
そうですね。同じ「熱」という指標で見ていますから、データを見たときに何が起きているのか?をイメージできることはとても大切だと思います。カロリメーターは何でも測定できる魔法のツールではありません。溶液中で起きている熱量変化を単純に測定しています。反応はサンプルの発熱だけでも吸熱だけでもありません。緩衝液や外気の影響なども十分考慮する必要がありますよね。
はい、肝に銘じておきます。
では、ちょっと休憩した後に、よくあるトラブルについてまとめてみましょうね。
よろしくお願いします!
その2へ続く
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